Microfluidizer® Технология лизиса клеток для генной терапии!!

Генная терапия (ГТ) применяется для лечения заболеваний на генетическом уровне. В случае идентификации гена или нуклеотида, ответственного за заболевание, терапия используется для замены данного гена, чтобы вылечить болезнь. Было предложено применять ГТ для лечения врожденной слепоты, гемофилии, болезни Паркинсона, множественной миеломы и многих других заболеваний. На сегодняшний день по всему миру выпускается несколько продуктов, изготовленных с использованием генной терапии.

Существует несколько способов применения ГТ: мутированный ген может быть заменен, мутированный и дисфункциональный ген может быть выключен, или может быть введен новый ген, помогающий организму бороться с болезнью. Для доставки данных терапевтических генов в качестве носителей благодаря своим некоторым свойствам наиболее часто выступают вирусные векторы. Вирусы могут эффективно инфицировать клетки, поражать широкий спектр клеток-хозяев и достигать высоких уровней трансфекции, некоторые же вирусные векторы могут трансфектировать даже неделящиеся клетки, а также быть непатогенными. Четырьмя основными классами вирусных векторов, используемых в доклинических и клинических исследованиях, являются аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (ААВ), ретровирусы и лентивирусы. Аденовирусы и ААВ в некоторых случаях более предпочтительны, поскольку они не интегрируются в геном.

Когда необходим лизис клеток?

Создание вируса включает в себя множество процессов производства и очистки. Разработка и оптимизация масштабируемых процессов производства, сбора и очистки вирусных векторов имеют решающее значение и могут быть трудновыполнимыми. Методы создания вирусов в лабораторных условиях обычно включают в себя трудно масштабируемые и трудоемкие процедуры, а также несут риски остаточного заражения. Такие векторы, как ААВ, обычно выращивают в клетках млекопитающих (HEK) или клетках насекомых, в связи с этим для высвобождения и сбора этих векторов необходим разрыв клетки. Стандартный метод лизиса клеток в производственной среде заключается в проведении нескольких циклов заморозки-оттаивания. Однако потенциальный риск загрязнения, связанный с процессом замораживания-оттаивания, делает его менее подходящим для крупномасштабного производства. Кроме того, данный процесс отнимает много времени и труда.

Технология Microfluidizer

Технология, Microfluidizer является наиболее приемлемым альтернативным методом лизиса клеток для сбора векторов. Данная уникальная технология обеспечивает более эффективное и последовательное преобразование давления жидкости в строго контролируемые усилия сдвига (рис. 1). Секрет эффективности технологии Microfluidizer заключается в конструкции эксклюзивной интерактивной камеры с фиксированной геометрией. Поскольку клетки проталкиваются через интерактивную камеру при заданном постоянном давлении и контролируемых температурах, производится точное и правильное количество равномерных усилий сдвига, которые разрушают клеточные мембраны, не повреждая вирусы. Технология Microfluidizer легко масштабируется, поэтому может применяться как в лаборатории, так и на производстве. Кроме того, в настоящее время уже имеется ряд готовых процессоров, соответствующих стандартам cGMP.

Здесь представлены результаты исследования по сравнению двух методов, применяемых для восстановления вируса: метода замораживания-оттаивания и технологии Microfluidizer. В этом исследовании векторы ААВ выращивали внутри клеток HEK293 и ресуспендировали в Трис-буфере перед лизированием, используя оба метода. В методе замораживания-оттаивания проводили 5 повторных циклов замораживания суспензии клеток в бане с сухим льдом / изопропанолом и затем оттаивания при 37 ° С для разрушения клеток. В методе гомогенизации Microfluidizer суспензию клеток обрабатывали один раз через процессор Microfluidizer, оборудованный интерактивной камерой H30Z (200 мкм) при 4000 фунтов на квадратный дюйм (275 бар).

В обоих случаях лизат центрифугировали в течение 30 минут для удаления остатков, а затем анализировали с помощью капельной цифровой полимеразной цепной реакции (ddPCR) для количественного определения титров ААВ. Микроскопические изображения клеток до и после этапа гомогенизации с помощью технологии Microfluidizer, представленные на рис. 2, ясно указывают на то, что за один проход удалось разрушить почти все клетки.

Ключевые преимущества технологии MICROFLUIDIZER

Подводя итог, можно сказать, что технология Microfluidizer обеспечивает ряд преимуществ в производстве вирусных векторов:

Высокая производительность — эффективное разрушение клеток для высвобождения вирусов без повреждения векторов. Процесс с использованием технологии Microfluidizer поможет также избежать агломерации вируса и связывания с мембранами, таким образом, достигается более высокий выход вектора по сравнению с другими методами.

Масштабируемость — линейное масштабирование от лабораторных установок до производственных с гарантированными результатами.

Соответствие cGMP — биофармацевтические модели разработаны с полным соответствием стандартам cGMP.

Более легкое выполнение последующих процессов — Технология обеспечивает мягкое, но эффективное разрушение клеток, что приводит к получению больших фрагментов клеточной стенки, которые легче отделить от меньших по размеру вирусных векторов. Процесс также может быть настроен на сдвиг клеточной ДНК и снижение вязкости. И то, и другое облегчает последующие процессы очищения и фильтрации.

Отсутствие химического / ферментативного загрязнения — может обеспечить обработку без использования специальных сред с незначительным износом. Нет необходимости в химическом лизисе, благодаря чему отсутствует дополнительная стадия удаления моющего средства, а также упрощается проведение последующих процессов.

Отсутствие дорогостоящих химикатов — отсутствие необходимости в использовании дорогостоящей нуклеазы, такой как Бензоназа, или значительное сокращение ее количества.